Polimerazinė grandininė reakcija

Polimerazinė grandininė reakcija (PGR, angl. polymerase chain reaction, PCR) – tai molekulinės biologijos metodas, leidžiantis padauginti (amplifikuoti) DNR (mėgintuvėlyje).

Karštųjų šaltinių bakterija Thermus aquaticus, atlaikanti iki 80° C karštį. PGR naudojama jos DNR polimerazė.

Pradmenys

Norint padauginti esamą DNR seką, reikia žinoti, kokie nukleotidai yra jos galuose. Pirmiausia cheminiais metodais susintetinami du DNR pradmenys, iš kurių pirmasis atitinka dauginamos sekos pradžią, o antrasis – kitos (papildančios) DNR grandinės pabaigą. Dauginama DNR yra dvigrandė, taigi abu pradmenys joje turi savo prikibimo vietas.

DNR polimerazė

Greta pradmenų, į reakcijos tirpalą dedama DNR polimerazė ir visų jai veikti reikalingų cheminių medžiagų. Kadangi mišinys bus kaitinamas, šis fermentas turi būti iš karščiui atsparaus organizmo.

Šios reakcijos sąlygomis DNR polimerazė tuomet gali sintetinti DNR grandinę, tęsdama ją nuo prikibusio pradmens:

DNR polimerazė negali pradėti sintezės bet kurioje DNR vietoje. Naujai sintetinamos DNR seka komplementari (A prieš T, T prieš A, G prieš C ir C prieš G) kaip matrica naudojamos senos DNR sekai.

Reakcijos žingsniai

1. Denatūravimo fazė – reakcijos tirpalas yra pakaitinamas iki 95 C°. Dėl karščio suyra „išsilydo“ dviguba DNR spiralė į dvi atskiras viengubas grandines. Tai yra reikalinga, kad pradmenų sekos galėtų sudaryti jungtis su kopijuojama DNR.
2. Hibridizacijos fazė – tirpalas atvėsinamas. Vėstant tirpalui DNR vėl sudaro dvigrandę struktūrą. Pirmiausia prie po denatūracijos fazės gautos viengrandės DNR grandinės prisijungia pradmenys. Jeigu tirpalas būtų vėsinamas iki kambario temperatūros iš naujo susijungtų visa mėginio DNR, tačiau tirpalas yra vėsinamas iki optimalios temperatūros, kada kopijuojama DNR ir primeriai sudaro dvigrandę struktūrą.
3. Pailginimo fazė – tirpalo temperatūra pakeliama iki DNR polimerazės optimalios veikimo temperatūros. DNR polimerazė pradeda veikti ir pratęsia visas dvigrandes DNR, prie kurių ji gali prisijungti, tarp jų ir pradmenio-kopijuojamos DNR sekas. Gaunamos dvigrandės DNR, kurių viena grandinė yra senoji, kuri veikė kaip šablonas, ir kita naujai susintetinta.

Kiekvienąkart pakartojus algoritmą, tiriamosios DNR sekos tirpale daugėja eksponentiškai. Todėl reakcija vadinama grandinine. Šios trys fazės kartojamos iki kol išsibaigia reagentai ir sulėtėja DNR dvigubėjimas:

Galimybės

Norint šiuo metodu padauginti DNR fragmentą, pakanka žinoti jo kraštų sudėtį; ilgis ir vidurio seka gali būti nežinomi. Tačiau DNR polimerazė kartais daro klaidas, todėl jei DNR dauginama sekai nustatyti, PGR ir po to sekantį sekos nustatymą reikia kartoti mažiausiai dukart.

PGR leidžia amplifikuoti mažą DNR kiekį iki reikiamo kiekio tolimesniems tyrimams (ligų detekcijai, tėvystės nustatymui, genų klonavimui ir kt.) Juo galima patikrinti, ar tiriamame genome yra dviem žinomais pradmenimis apribota seka ir taip nustatyti, ar šis organizmas turi (ar galbūt evoliucinėje praeityje turėjo) žinomos sekos geną. Kai kada skirtinguose organizmuose skiriasi pradmenimis apribotos sekos ilgis. Kadangi padaugintos sekos ilgį nustatyti nesunku, tokios sekos naudojami kaip „dirbtiniai genai“, kurių atžvilgiu (panaudojant persikryžiavimo dėsnius) nustatoma su paveldimomis ligomis ar šiaip išoriškai stebimais požymiais susijusio geno padėtis.

Įprastiniu PGR gali būti padauginamas ne ilgesnis kaip keleto tūkstančių nukleotidų porų fragmentas.

Variantai

Naudojant atvirkštinę transkriptazę, galima gauti PGR reakciją (), kurios pradinė matrica yra RNR.

Būtini komponentai

Termocikleris

PGR reakcijos tirpale turi būti DNR matrica, , dNTP, DNR polimerazė, sistema, kofaktorius Mg²⁺. Taip pat reikalingas specialus prietaisas (termocikleris), kuris periodiškai keičia reakcijos tirpalo temperatūrą.

Istorija

Praeityje lietuvių biochemikai pasigamindavo šį prietaisą iš kompiuterinio spausdintuvo, priversdami jo galvutę kilnoti mėgintuvėlį po skirtingos temperatūros tirpalus. Parašydavo jie ir tam reikalingą programinę įrangą.